Protein A-agarose

貨號：P0231

儲存條件：4℃保存，有效期一年。請勿冷凍。

產品描述

Protein A Agarose 主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化。

Protein A是一種發現于jin黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細胞壁表面蛋白，分子量為42kDa；適當重組改造的Protein A、G與瓊脂糖凝膠(agarose)以一定的方式結合，可用于免疫沉淀或抗體的純化。Protein A Agarose適合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG4，mouse IgG2a、IgG2b及rabbit IgG等。

本品中的重組Protein A可與多數哺乳動物IgG的Fc端特異性結合，分子量為14kDa。該重細Protein A經過基因工程技術的改造，使其成為耐堿結構域，從而實現Protein A的耐堿特性，并僅保留了與IgG Fc端結合相關的氨基酸序列，去除了結合位點以外可能導致非特異性結合的序列，從而可以有效減少非特異性結合。

本品中的Protein A共價連到大孔徑瓊脂糖上。每ml Protein A agarose beads (沉淀物)可以結合超過60mg human IgG。本品中agarose beads的平均直徑為45-165um，抗體純化時的推薦線性流速為，400cm/h，耐壓指數最高為0.5MPa。工作pH值范圍為3-12。

本產品配制在可以直接用于免疫沉淀和抗體純化的適當溶液中，每ml中共含有0.25ml agarose beads (沉淀物)。如果用于常規的免疫沉淀，每ml本產品(沉淀和溶液為1:3的混合物)可以免疫沉淀50次。

注意事項

1.請勿冷凍保存本產品。

2.Protein A Agarose使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻。

3.本產品含有微量的防腐劑，不會影響常規的免疫沉淀和抗體純化。但如果后續涉及酶活性測定，使用本產品前宜先用TBS等適當溶液洗滌Protein A agarose beads三次，以充分消除防腐劑可能產生的干擾。

4.從蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4度或冰上操作。

5.本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

6.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明:

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):

a. 蛋白樣品的準備:

(a) 對于10cm細胞培養皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養液，PBS洗滌一次，然后加入500ul至2ml細胞裂解液裂解細胞?？墒褂肔ABLEAD生產的Westen及IP細胞裂解液（Cat：W0013）或各種RIPA裂解液（Cat：R1090/R1091）等進行細胞的裂解。

(b) 對于組織樣品參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解。

(c) 對于懸浮細胞，離心收集細胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解。

注:詳細的裂解方法參考不同裂解液的詳細使用方法。對于不同的培養器材，參考10厘米培養皿的裂解液的用量進行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量。

b. 去除非特異性結合(可選做):

(a) 取200ul~1ml蛋白樣品，蛋白量約為200ug至1mg，加入約1ug和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG.

和20ul充分重懸的Protein A Agarose，4°C緩慢搖動30min至2h。

(b) 2500rpm(約1000g)離心5min，取上清用于后續的免疫沉淀。

注：所謂種屬相同的IgG是指后續免疫沉淀時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無normal IgG，可以加入其它不影響后續檢測的mouse IgG類型的抗體。通過和normal IgG和Protein A Agarose的孵育，可以充分降低非特異性的結合，降低背景。

c. 免疫沉淀：

(a) 加入0.2-2ug用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動過夜。

(b) 再加入20ul充分重懸的Protein A Agaose，4℃緩慢搖動1-3h(為方便后續的洗滌操作，可以把加入充分重懸的Protein A Agatose的量調整為40ul)。

(c) 2500rpm(約1000g)離心5min，或瞬時高速離心，小心吸除上清，注意可留下少量上清但不能吸掉Protein A Aganose。

(d) 用準備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1ml。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同步驟(c)。

(e) 完成最后一次洗滌后，去除上清，加入20-40ul 1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Votex重懸沉淀，瞬時高速離心把樣品離心至管底。

(f) 100°C或沸水浴處理3-5min，取部分或全部樣品用于SDS-RAGE電泳，暫時不用的樣品可以-20°C保存。

2．免疫共沉淀:

參考免疫沉淀的方法進行，但免疫共沉淀(Co-P)通常必須使用未經凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。

3．抗體純化:

a. 準備工作：

(a) 用0.45um或0.2um孔徑的濾膜過濾所用的溶液。

(b) 所有的溶液必須用超聲等方法脫氣(degas)。

(c) 選擇適當的純化柱，用適當量的Protein A Agarose裝填純化柱。也可使用LABLEAD的預裝柱產品（Cat:P0231G）

(d) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌并平衡純化柱，流速可以用恒流泵控制為1ml/min (1ml預裝柱)。如無恒流泵，也可以完quan依靠重力洗滌并平衡純化柱。

b. 抗體純化：

(a) 把含有待純化的抗體上樣到純化柱。

(b) 待純化的抗體過柱后，用10-20倍柱體積的TBS洗滌，以去除未結合和非特異性結合的蛋白。洗滌是否完quan可以通過測定280nm的吸光度進行確定。

(c) 洗滌完后，用10ml 50mM glycine，pH2.7作為洗脫液洗脫結合的抗體。某些抗體和Protein A的結合能力很強，在pH2.7時洗脫效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作為洗脫液。分管收集洗脫下的抗體，根據蛋白濃度或后續的檢測效果確定洗脫峰在哪幾個收集管中。

c. 純化柱的再生：

(a) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌純化柱，使純化柱達到中性的pH。

(b) 用TBS來保存再生的純化柱。